新经济观察 抗体药物,包括单抗、双抗、抗体片段、抗体偶联药物以及抗体融合蛋白等,具有靶向性强、特异性高和毒副作用小等特点,在自身免疫疾病与抗肿瘤领域大放异彩。面对庞大的市场需求,开发新型抗体药物,优化下游生产工艺,具有非常重要的经济价值与社会意义。
1.抗体纯化工艺
抗体纯化过程复杂,需结合多种分离手段设计出合理的纯化流程,才能高效地获得高质量产品。抗体下游工艺通常由以下步骤构成:
细胞澄清收获,通过离心和过滤等方法去除细胞和细胞碎片;亲和捕获,Protein A 亲和层析捕获抗体;低pH孵育去除病毒;中间纯化与精纯,去除产品和过程相关杂质;纳滤与超滤,去除病毒获得最终抗体产品。
2.抗体分离纯化中的层析技术
(1)捕获
该步骤目的是从大量成分复杂的发酵液中快速捕获目的抗体,Protein A 源于金黄色葡萄球菌,特异性结合IgG FC片段,往往一步纯化即可达到90%以上的纯度,能捕获人源抗体(非IgG3)及FC融合蛋白,是捕获抗体蛋白最有效的层析手段。低pH洗脱衔接低pH孵育,病毒可有效减少7~8 log,后续仅需1~2步纯化即可完成整个抗体的纯化。选择Protein A层析介质时,载量、流速、耐碱性、使用寿命以及Protein A残留量是主要考量因素。
(2)中间纯化与精纯
为达安全纯度,捕获后的抗体样品应进一步去除宿主蛋白、宿主DNA、聚集体、抗体片段、内毒素和脱落的Protein A等产品和过程相关杂质,离子交换层析与疏水层析是该步骤常用的层析手段。
离子交换层析是依据抗体与杂质的带电性差异来实现分离纯化的目的,是抗体纯化过程中关键步骤。阴离子交换层析常采用流穿模式去除内毒素、病毒、HCD、HCP等杂质。而阳离子交换层析则常选择结合洗脱模式,在酸性条件下,多数抗体结合在介质上,通过增加洗脱缓冲液中的盐浓度或提高pH进行洗脱,除杂效果明显,尤其是兼具高分辨率与高选择性的阳离子交换层析介质例如博格隆MegaPoly BXS、博格隆Diamond CD-S以及博格隆Diamond SP Mustang等产品在去除聚集体、宿主蛋白HCP以及Protein A 方面效果显著。
疏水层析与离子交换层析互补,多数情况下抗体的疏水性要强于大部分杂质,主要用于抗体聚集体和HCP的去除。HIC介质的疏水性对收率和杂质去除效果有较大影响,因此选择合适的配基是疏水层析的关键,博格隆常见的疏水作用层析配基的疏水性强弱顺序如下:Butyl-S<butyl<octyl<phenyl。< p=””>
除此之外,例如博格隆Diamond MMC与博格隆Diamond MIX-A等兼具疏水作用与离子交换作用的多模式填料越来越受到重视,这类新型的混合模式介质对宿主蛋白、脱落的配基以及多聚体等杂质具有高效的去除能力,可有效简化纯化步骤,增加纯化效率。
随着抗体药物在临床治疗中的广泛应用,下游纯化工艺的开发显得越发重 要,灵活运用各种层析模式与正确选择层析填料将为抗体纯化提供更经济高效的工艺路线。
